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Srp
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In einer anschließenden Studie lieferten wir Beweise dafür, dass Cholesterin bidirektional zwischen gereinigtem NPC1(NTD) und NPC2 übertragen werden könnte (Infante et al., 2008c). Wenn [3H]cholesterin bei 4°C an NPC1(NTD) gebunden war, war die Dissoziationsrate in Waschmittel extrem langsam, aber das [3H]Cholesterin übertrug sich schnell auf NPC2. Die Übertragung könnte auch in die entgegengesetzte Richtung gehen: NPC2 übertrug sein gebundenes [3H]Cholesterin auf NPC1(NTD) zwei Größenordnungen schneller als bei der Lieferung von [3H]cholesterin an NPC1(NTD) in Waschmittellösung (Infante et al., 2008c). NPC2 kann gebundenes Cholesterin auch ohne NPC1 direkt an Liposomen liefern (Cheruku et al., 2006; Babalola et al., 2007; Xu et al., 2008; Infante et al., 2008c). NPC1(NTD) konnte jedoch sein gebundenes Cholesterin nur dann an Liposomen liefern, wenn NPC2 als Zwischenträger vorhanden war. Obwohl diese Studien eine einzigartige Fähigkeit von NPC2 zeigten, das Ein- und Ausstieg von Cholesterin aus NPC1 (NTD) zu erleichtern, gaben sie nicht an, in welche Richtung dieser Transfer innerhalb von Lysosomen, d. h. LDL zu NPC2 zu NPC1 vs. LDL zu NPC1 zu NPC2, ging.

Obwohl das NPC2-zu-NPC1-Modell logischer erscheint (Infante et al., 2008c; Subramanian und Balch, 2008; Schulze et al., 2009), fehlen direkte Daten zur Unterstützung dieses Modells. Immunoblotting ergab, dass die mutierten Proteine auf dem gleichen Niveau wie WT exprimiert wurden (Abbildung 5F, Einset). Sowohl mutierte als auch WT-Proteine zeigten ein diffuses Band, das für vollständig glykosylierte lysosomale Proteine charakteristisch ist, die den ER verlassen haben (Watari et al., 1999). Darüber hinaus änderte die Behandlung der mutierten Proteine mit der Glykosidase Endo H (die nur hohe Mannoseketten entfernt) ihr Migrationsmuster auf SDS-PAGE nicht, was einen weiteren Beweis dafür lieferte, dass sich die mutierten Proteine richtig gefaltet hatten und den ER verließen (Daten wurden nicht angezeigt). Im selben Experiment zeigte die Endo-H-Behandlung eines Kontrollproteins, das eine hohe Mannosekette (Site-1-Protease) (DeBose-Boyd et al., 1999) enthielt, die erwartete Zunahme der elektrophoretischen Mobilität. Basierend auf der Größenausschlusschromatographie wurde der lösliche NPC1(NTD) als Dimer vermutet (Infante et al., 2008b). Frühere Ergebnisse mit glykosylierten Proteinen haben ein anomales Migrationsverhalten bei der Größenausschlusschromatographie gezeigt (Andrews, 1965). Wir verwendeten analytische Ultrazentrifugations-Sedimentationsgeschwindigkeit (SV)-Analyse, um den Oligomerisierungszustand von NPC1 (NTD) in Lösung zu bestimmen. Die SV-Analyse von NPC1(NTD), die in CHO-K1-Zellen mit allen 6 der vorhergesagten oder identifizierten Glykosylierungsstellen durchgeführt wurde, zeigte eine einzelne Art von 3,2 S, was einer Molekularmasse von 41,9 kDa (35 % des Kohlenhydratgehalts nach Masse) entspricht (Abbildung S3). Die SV-Analyse des in Insektenzellen produzierten Proteins, bei dem 3 der Glykosylierungsstellen mutiert waren, zeigte eine einzelne Art von 2,2 S, die einer Molekularmasse von 30,3 kDa entspricht (15 % Kohlenhydratgehalt nach Masse) (Abbildung S3).